METODE UZGOJA MIKROORGANIZMA. STUDIJ KULTURNE I BIOKEMIJSKE
SVOJSTVA
Uzgoj, odnosno uzgoj mikroorganizama u laboratoriju, koristi se za proučavanje njihovih svojstava i dobivanje biomase. Bakterije, gljive, aktinomicete, spirohete i neke protozoe uzgajaju se na hranjivim podlogama. Klamidija, rikecija, virusi i neke protozoe mogu se razmnožavati samo u tijelu životinje ili u živim stanicama.
Kulturna svojstva ove vrste mikroorganizama su: 1) uvjeti potrebni za reprodukciju i 2) priroda rasta na hranjivim podlogama. Kulturna svojstva jedna su od karakteristika koje se uzimaju u obzir pri identificiranju (određivanju vrste) mikroorganizama.
Mediji za kulturu
Mediji za kulturu moraju ispunjavati određene zahtjeve. Moraju sadržavati sve hranjive tvari potrebne za reprodukciju ove vrste mikroba. Neki patogeni mikroorganizmi rastu na jednostavnim hranjivim medijima, dok je drugima za njihovu reprodukciju potreban dodatak krvi, krvnog seruma i vitamina.
U mediju za uzgoj moraju se stvoriti određeni uvjeti dodavanjem otopine natrijevog klorida ili pufera. Za većinu bakterija povoljan je hranjivi medij koji sadrži 0,5% natrijevog klorida. Reakcija hranjivog medija, povoljnog za većinu patogenih bakterija, blago je alkalna, što odgovara pH = 7,2-7,4. Vibrio cholerae raste pri pH = 7,8-8,5, gljive-pri pH = 5-5,5. Mediji za kulturu trebaju biti vlažni, odnosno sadržavati dovoljnu količinu vode, biti što transparentniji i sterilni, odnosno prije sjetve ne smiju sadržavati mikrobe.
Po sastavu i podrijetlu hranjivi su mediji prirodni, umjetni i sintetički. Mediji prirodne kulture prirodni su proizvodi poput krumpira i drugog povrća. Umjetni hranjivi mediji pripremaju se prema specifičnoj recepturi od proizvoda s dodatkom organskih i anorganskih spojeva. Sintetički mediji sadrže određene kemijske spojeve u poznatim koncentracijama.
Po konzistenciji, hranjivi mediji su tekući, polutekući, gusti. Agar-agar-polisaharid izoliran iz algi obično se koristi kao brtvilo. Agar-agar mikroorganizmi ne koriste kao hranjivo; on stvara gel u vodi koji se topi na 100 ° C i učvršćuje na 45 ° C.
Za dobivanje gustog hranjivog medija dodaje se agar-agar u koncentraciji od 1,5-2%, za polutekući-0,5%.
Prema namjeni, kulturološki se mediji mogu podijeliti na obične (jednostavne), posebne, izborne, diferencijalnu dijagnostiku.
Uobičajeni (jednostavni) hranjivi mediji koriste se za uzgoj većine mikroorganizama, to je mezopatamijska juha (MPB), mezopatamijski agar (MPA).
Za uzgoj mikroorganizama koji ne rastu na jednostavnim podlogama koriste se posebni hranjivi mediji. Na primjer, krvni agar i šećerna juha za streptokoke, serumski agar za meningokok i gonokok.
Mediji za izbor kulture koriste se za izolaciju jedne vrste iz mješavine različitih bakterija. Ova vrsta bakterija raste u ovoj okolini brže i bolje od drugih, nadmašujući ih u svom rastu; rast drugih bakterija je odgođen na ovom mediju. Na primjer, koagulirani serum za difterijski bacil, alkalna peptonska voda za koleru vibrio, žučna juha za tifusni bacil, slana podloga za stafilokok.
Hranjivi mediji za diferencijalnu dijagnostiku koriste se za razlikovanje nekih vrsta bakterija od drugih po njihovom enzimskom djelovanju (vidi odgovarajući odjeljak).
Uzgoj i izolacija čistih kultura aerobnih bakterija
Za uzgoj mikroorganizama potrebni su određeni uvjeti: temperatura, aerobni ili anaerobni uvjeti.
Temperatura bi trebala biti optimalna za vrstu. Većina patogenih bakterija uspijeva na 37 ° C. Međutim, za neke je vrste optimalna niža temperatura, što je povezano s osobitostima njihove ekologije. Dakle, za bacil kuge, čije su prirodno stanište glodavci tijekom hibernacije, optimalna temperatura je 28 ° C, kao i za leptospiru, za bacil botulizma - 28 ° C -35 ° C.
Osim optimalne temperature, za uzgoj mikroorganizama, ovisno o vrsti, potrebno je aerobno ili anaerobno okruženje.
Za proučavanje morfologije, kulturnih, biokemijskih i drugih svojstava mikroba potrebno je dobiti čistu kulturu. Obično se kultura mikroba naziva njihovo nakupljanje na hranjivom mediju u obliku zamućenosti, rasta pri dnu (stijenke) ili filma na površini tekućeg medija ili kolonija na gustom mediju. Jedna kolonija nastaje od jedne mikrobne stanice. Čista kultura je kultura mikroba iste vrste dobivena iz jedne kolonije. U laboratorijima se za različite studije koriste određeni poznati sojevi mikroba. Soj je čista kultura mikroba dobivena iz određenog izvora, u određeno vrijeme, s poznatim svojstvima. U pravilu su mikrobni sojevi označeni određenim brojem. Na primjer, soj Staphylococcus aureus 209P koristi se za određivanje aktivnosti penicilina.
Izolacija čistih kultura aeroba obično traje tri dana i provodi se prema sljedećoj shemi:
1. dan - mikroskopija razmaza s ispitivanog materijala, obojenog (obično po Gramu) - za prethodno upoznavanje s mikroflorom, što može biti korisno pri odabiru podloge za cijepanje. Zatim se inokulira materijal na površini smrznutog hranjivog agara radi dobivanja izoliranih kolonija. Prosijavanje se može provesti prema Drygalsky metodi u tri Petrijeve zdjele s hranjivim medijem. Kap materijala nanosi se na prvu šalicu i lopaticom se razmazuje po cijeloj šalici. Zatim istom lopaticom rasporedite preostalu kulturu po njoj na drugu šalicu i na isti način na treću. Najveći broj kolonija izrast će na prvoj ploči, a najmanje na trećoj. Izolirane kolonije izrast će na jednoj od ploča, ovisno o tome koliko je mikrobnih stanica bilo u ispitivanom materijalu.
Isti rezultat može se postići prosijavanjem na jednu šalicu. Da biste to učinili, podijelite šalicu na četiri sektora. Materijal koji se proučava inokulira se bakteriološkom petljom s potezima na prvom sektoru, a zatim se, nakon kalcinacije i hlađenja petlje, cijepljenje raspoređuje iz prvog sektora u drugi i na isti način uzastopno u treći i četvrti sektor. Izolirane kolonije nastaju od pojedinačnih mikrobnih stanica nakon svakodnevne inkubacije u termostatu.
2. dan - proučavanje kolonija uzgojenih na pločama, njihov opis. Kolonije mogu biti prozirne, prozirne ili neprozirne, različitih su veličina, zaobljenih pravilnih ili nepravilnih obrisa, konveksnog ili ravnog oblika, glatke ili hrapave površine, glatkih ili valovitih, nazubljenih rubova. Mogu biti bezbojne ili bijele, zlatne, crvene, žute. Na temelju proučavanja ovih karakteristika odrasle kolonije dijele se u skupine. Zatim se iz ispitivane grupe odabere izolirana kolonija, pripremi se bris za mikroskopsko ispitivanje radi provjere homogenosti mikroba u koloniji. Ista se kolonija inokulira u epruvetu s kosim hranjivim agarom.
3. dan - provjera čistoće kulture uzgojene na kosini agara mikroskopijom razmaza. S homogenošću proučavanih bakterija, izolacija čiste kulture može se smatrati potpunom.
Kako bi se identificirale izolirane bakterije, proučavaju se kulturne osobine, odnosno priroda rasta na tekućim i čvrstim hranjivim medijima. Na primjer, streptokoki na šećernoj juhi tvore dno i parijetalni sediment, na krvnom agaru - male, točno određene kolonije; cholera vibrio tvori film na površini alkalne peptonske vode i prozirne kolonije na alkalnom agaru; bacil kuge na hranjivom agaru tvori kolonije u obliku "čipkastih rupčića" s gustim središtem i tankim valovitim rubovima, a u tekućem hranjivom mediju - film na površini, a zatim se iz njega protežu vlakna u obliku "stalaktita" ".
Uzgoj i izolacija čistih kultura anaerobnih bakterija
Za uzgoj anaeroba potrebno je smanjiti oksidacijsko-redukcijski potencijal medija, stvoriti anaerobiozu uklanjanjem kisika fizikalnim, kemijskim ili biološkim metodama.
Fizičke metode uključuju:
1) mehaničko uklanjanje zraka pomoću pumpe iz anae-rostata, u koje se stavlja posuda s inokulacijom. Istodobno možete zamijeniti zrak indiferentnim plinom: dušik, vodik, ugljični dioksid.
2) uzgoj u mediju koji sadrži reducirajuće tvari. Kitta-Tarozzi srijeda je šećerna juha s komadićima jetre ili mesa. Glukoza i dijelovi organa imaju sposobnost reduciranja. Medij se na vrh prelije slojem vazelinskog ulja kako bi se blokirao pristup kisiku zraka.
3) Najjednostavnija, ali manje pouzdana metoda je uzgoj duboko u visokom stupcu šećernog agara.
Kemijske metode sastoje se u tome što se posude s usjevima anaeroba stavljaju u hermetički zatvoreni eksikator, gdje se stavljaju kemikalije, na primjer, pirogalol i lužine, čija reakcija teče apsorpcijom kisika.
Biološka metoda temelji se na istovremenom uzgoju anaeroba i aeroba na krutim hranjivim medijima u Petrijevim posudama, hermetički zatvorenim nakon inokulacije. Prvo rastući aerobi apsorbiraju kisik, a zatim počinje rast anaeroba.
Izolacija čiste kulture anaeroba počinje nakupljanjem anaerobnih bakterija inokulacijom na Kitta-Tarozzijev medij. U budućnosti se izolirane kolonije dobivaju na jedan od dva načina:
1) materijal se cijepi miješanjem s otopljenim toplim šećerom u staklenim epruvetama. Nakon što se agar učvrstio, u njegovoj dubini rastu izolirane kolonije koje se uklanjaju rezanjem cijevi i subkulturiraju na Kitt-Tarozzijevom mediju (Weinbergova metoda);
2) inokulacija materijala provodi se na pločama s hranjivim medijem i inkubira u anaerostatu. Izolirane kolonije uzgojene na ploči subkulturirane su na Kitt-Tarozzijevom mediju (Zeisslerova metoda).
Uzgoj drugih mikroorganizama
Uzgoj mikoplazmi
Mikoplazme se uzgajaju na hranjivim medijima nadopunjenim serumom i ugljikohidratima. Budući da mikoplazmama nedostaje stanična stijenka, one rastu samo u izotoničnim ili hipertoničnim okruženjima. Na krutim hranjivim podlogama nekoliko dana nastaju vrlo male kolonije, nalik prženim jajima - s ispupčenim središtem i ravnom prozirnom periferijom. Mikoplazme se također mogu uzgajati u kokošjim zametcima ili staničnoj kulturi.
Uzgoj rikecije i klamidije
Rikecije i klamidije obvezni su unutarstanični paraziti. Za njihov uzgoj koriste se stanične kulture, pileći zametci i infekcije životinja.
Uzgoj gljiva
Za uzgoj gljiva koriste se gusti i tekući hranjivi mediji: najčešće Sabouraudov medij, kao i mediji koji sadrže pivsku sladovinu. Gljive rastu sporije od bakterija, formiraju vidljiv rast u roku od nekoliko dana. Temperatura uzgoja niža je od temperature bakterija - 22-30 ° C.
Uzgoj spiroheta i protozoa
Među spirohetama je najlakše uzgojiti leptospiru, kojoj voda pomiješana sa serumom krvi kunića može poslužiti kao hranjivi medij.Borelije i treponeme uzgajaju se u anaerobnim uvjetima na složenijim hranjivim medijima koji sadrže serum, komadiće životinjskog tkiva.
Među protozoama, na hranjivim podlogama uzgajaju se dizenterijska ameba, lamblija, trihomonas, lajšmanija, tripanosom, balantidija, dok se toksoplazma uzgaja u kokošjim zametcima i kulturama tkiva. Metode uzgoja malarijske plazmodije su u razvoju.
Metode proučavanja enzimske aktivnosti (biokemijska svojstva)
U mikrobiološkoj praksi proučavanje enzimske aktivnosti koristi se za identifikaciju mikroorganizama, budući da svaka mikrobna vrsta ima određeni skup enzima.
Za određivanje proteolitičke aktivnosti mikrobi se inokuliraju injekcijom u stupac želatine, a nakon 3-5 dana inkubacije na sobnoj temperaturi primjećuje se karakter ukapljivanja želatine: u obliku lijevka, čavla, čarape ili u obliku prevrnutog božićnog drvca. Proteolitička aktivnost određena je i stvaranjem produkata razgradnje proteina: indola, sumporovodika, amonijaka. Kako bi se odredili, mikroorganizmi se inokuliraju u mesno-peptonsku juhu, a indikatorski papiri stavljaju se između grla epruvete i pamučnog čepa, isključujući njihov kontakt s medijem. Kad nastane indol, papir impregniran zasićenom otopinom oksalne kiseline dobiva ružičastu boju; u prisutnosti sumporovodika, papir impregniran olovnim acetatom postaje crn; pri stvaranju amonijaka crveni lakmus papir postaje plav.
Za određivanje saharolitičkih svojstava mikroba koriste se diferencijalno dijagnostički mediji, poput Gissovog medija, Olkenitskog, Endovog, Levinovog, Ploskirevljevog medija.
Mediji Endo, Levin, Ploskirev u Petrijevim posudama koriste se za razlikovanje bakterija crijevne skupine prema njihovoj sposobnosti fermentacije laktoze. Ovi mediji sadrže hranjivi agar, laktozu i indikator koji mijenja boju u kiselom mediju - pH indikator. Ako posijete bakterije koje fermentiraju laktozu, poput E. coli, u takvo okruženje, kiselina se stvara kao posljedica fermentacije laktoze, a indikator će promijeniti boju u kiselom okruženju. Stoga će kolonije Escherichia coli na takvim medijima biti obojene prema boji indikatora: na Endovom i Ploskirevovom mediju - u crvenoj boji, na Levinovoj podlozi - u crnoj i plavoj boji. Kolonije bakterija koje ne fermentiraju laktozu, poput salmonele i dizenterije, bit će bezbojne.
Gissovi mediji (mediji s raznolikim rasponom) pripremaju se na bazi peptonske vode ili polutekućeg mesno-peptonskog agara. Sadrži bilo koji ugljikohidratni ili polihidrični alkohol i indikator. Kad na Gissovom mediju raste mikrob, fermentirajući ovaj supstrat stvaranjem kiseline i plina, medij će promijeniti boju, u polutekućem mediju pojavit će se mjehurići i puknuća u debljini agara, u tekućem mediju - mjehurić plina u staklenom plovku. Kad se supstrat fermentira samo u kiselinu, dolazi samo do promjene boje medija.
Također se koriste kombinirani mediji koji ne sadrže jedan ugljikohidrat, već dva ili tri, na primjer, medij Olkenitskog. Jedna cijev ovog medija zamjenjuje agar koso i Giss medij laktozom, glukozom i saharozom. Nakon sterilizacije u rastaljenom stanju, medij u epruveti se zakosi tako da se dobije stupac i ukošeni dio. Sjetva se vrši potezom na skošenom dijelu i ubodom u stupac. Prilikom fermentacije laktoze ili saharoze mijenja se boja cijelog medija; kada se fermentira jedna glukoza, mijenja se samo boja stupca. Formiranje plina označeno je prisutnošću mjehurića u stupcu agara. Kada mikrobi otpuštaju amonijak, boja medija se ne mijenja. Stvaranje sumporovodika očituje se pocrnjenjem u tablici s agarom
Za ekspresnu metodu za određivanje enzimske aktivnosti bakterija koriste se sustavi mikrotesta i sustav indikatorskog papira (NIB)
Sustav mikrotesta je spremnik od prozirnog polistirena, koji se sastoji od nekoliko stanica. Stanice sadrže osušene hranjive medije s ugljikohidratima i pH pokazateljima. U svaku ćeliju se cijepi suspenzija kulture bakterija određene gustoće. Ulije se slana otopina u kontrolne ćelije. boje
indikator
Sustavi s indikatorskim papirom (NIB) za identifikaciju obitelji enterobacteriaceae su diskovi ili trake od kromatografskog papira, prekrivene zaštitnom folijom koje sadrže određenu podlogu i indikator. Promjenom boje indikatora Za određivanje sumporovodika disk je postavljen na površinu MPA, zasijan injekcijom, što omogućuje istovremeno određivanje pokretljivosti
U svim epruvetama uzima se u obzir preliminarni rezultat istog dana i konačni rezultat sljedećeg dana.
Aktivnost oksidaze određuje se trljanjem kulture na indikatorskom papiru, a rezultat se uzima u obzir nakon minute.
IZOLIRANE TKIVNE I BILJNE STANICE
Uzgoj izoliranih stanica i tkiva na umjetnim hranjivim podlogama u sterilnim uvjetima (in vitro) dobio naziv metode kulture izoliranog tkiva.
Zbog činjenice da su sjemenske biljke od najveće važnosti u ljudskom životu, metode i uvjeti za njihov uzgoj razvijeni su bolje nego za golosjemenjače ili alge, čiji uzgoj u sterilnim uvjetima izaziva određene poteškoće. No, bez obzira na pripadnost biljaka određenoj taksonomskoj skupini, postoje opći zahtjevi za uzgoj predmeta u kulturi. in vitro.
Asepsa. Prije svega, uzgoj fragmenata tkiva ili biljnih organa - eksplantata, a još više pojedinačnih stanica, zahtijeva potpunu asepsu. Mikroorganizmi koji mogu ući u hranjivi medij oslobađaju toksine koji inhibiraju rast stanica i dovode do smrti kulture. Stoga, za sve manipulacije sa stanicama i tkivima tijekom uzgojain vitro pridržavati se određenih pravila asepse u laminarnoj kutiji ili u aseptičnim prostorijama. U prvom slučaju, asepsa se postiže opskrbom radnika filtriranim sterilnim zrakom usmjerenim iz laminarne kutije prema van. Aseptične prostorije steriliziraju se ultraljubičastim lampama i u takvim prostorijama rade u sterilnoj odjeći. Radna površina stolova u aseptičnim prostorijama i alata prije rada dodatno se sterilizira alkoholom.
Čisto posuđe prethodno omotano papirom ili folijom, alati, papir, vata steriliziraju se suhom toplinom u pećnici na 160 ° C 1,5-2 sata. Mediji za kulturu steriliziraju se u autoklavu na 120 ° C i visokom tlaku unutar 15 - 20 minuta. Ako medij za uzgoj sadrži tvari koje se raspadaju tijekom autoklaviranja, treba ih sterilizirati filtriranjem kroz bakterijski filtar. Zatim se sterilne filtrirane komponente dodaju u prethodno autoklavirani medij ohlađen na temperaturu od 40 ° C.
Sama biljna tkiva mogu poslužiti kao ozbiljan izvor infekcije, budući da se epifitska mikroflora uvijek nalazi na njihovoj površini. Stoga je nužna površinska sterilizacija koja se provodi na sljedeći način. Prethodno se dio biljke iz kojeg će se ekstrahirati eksplant ispere sapunom i vodom i ispire čistom vodom. Zatim se biljni materijal sterilizira u otopinama dezinficijensa. Neke od ovih tvari, kao i vrijeme sterilizacije prikazane su u tablici. 6.1.
|
Tablica 6.1 Sterilizacija izvornog biljnog materijala (prema R.G.Butenko, 1999.) Objekt |
Vrijeme sterilizacije, min |
||
|
kisela kiselina 0,1% |
živin klorid 0,1% |
vodikov peroksid, 10-12% |
|
|
Sjemenke su suhe |
15-20 |
10-15 |
12-15 |
|
Sjemenke su natečene |
6-10 |
6-8 |
6-8 |
|
Matično tkivo |
20-40 |
20-25 |
— |
|
Lišće |
1-3 |
0,5-3 |
‘ 3-5 |
|
Vrhovi |
1-10 |
0,5-7 |
2-7 |
Nakon držanja eksplantata u otopini za dezinfekciju, oni se nekoliko puta isperu u destiliranoj vodi, a vanjski sloj stanica na kriškama eksplantata ukloni se skalpelom jer se može oštetiti tijekom sterilizacije.
Mikroorganizmi se mogu naći i unutar biljnog tkiva. Unutarnja infekcija najčešća je u tropskim i suptropskim biljkama. Stoga je, osim površinske sterilizacije, ponekad potrebno koristiti i antibiotike, koji ubijaju mikrobnu floru unutar tkiva. Međutim, valja napomenuti da takav tretman ne dovodi uvijek do sterilizacije unutarnjih tkiva, budući da je teško odabrati ciljani antibiotik.
Mediji za kulturu. Izolirane stanice i tkiva uzgajaju se na višekomponentnim hranjivim podlogama. Po svom sastavu mogu se značajno razlikovati, međutim, sastav svih medija nužno uključuje makro- i mikroelemente potrebne biljkama, ugljikohidrate, vitamine, fitohormone i njihove sintetičke analoge. Ugljikohidrati (obično saharoza ili glukoza) uključeni su u bilo koju prehrambenu formulu u koncentraciji od 2-3%. Oni su neophodni kao nutritivna komponenta, budući da većini tkiva kalusa nedostaje klorofil i nisu sposobni za autotrofnu prehranu. Stoga se uzgajaju u uvjetima difuznog osvjetljenja ili u mraku. Izuzetak je kalusno tkivo mandragore, amaranta i nekih drugih biljaka.
Neizostavne komponente podloge za kulturu trebaju biti auksini koji uzrokuju dediferencijaciju eksplantnih stanica i citokinini koji induciraju diobu stanica. Kad se omjer između ovih fitohormona promijeni ili kada se dodaju drugi fitohormoni, mogu se uzrokovati različite vrste morfogeneze.
Visok sadržaj nitrata, amonijevih iona, kalija, fosfata potiče brzi rast stanica. Osiromašenje okoliša značajno smanjuje rast i procese sekundarnog metabolizma. Međutim, početno nizak sadržaj fosfata u hranjivom mediju može potaknuti sintezu sekundarnih metabolita. Utvrđeno je da uzgoj sladića u mediju sa pola koncentracije dušika i fosfora u mraku povećava sadržaj fenolnih spojeva za 1,6 puta u odnosu na kaluse koji rastu na potpunom mediju. U medij se može dodati endosperm nezrelih embrija (kokos, konjski kesten itd.), Sokovi nekih stabala, različiti ekstrakti (slad, kvasac, sok od rajčice). Upoznavanje s okolinom. do daje zanimljive rezultate, ali takve je pokuse teško reproducirati jer se aktivni sastojak obično ne zna točno. Na primjer, dodavanje odvojenih frakcija kokosovog mlijeka u hranjivi medij nije dalo nikakve rezultate, dok je nefrakcionirani endosperm uzrokovao diobu stanica.
Pri pripremi krutih hranjivih podloga za površinski uzgoj tkiva kalusa koristi se pročišćeni agar-agar, polisaharid dobiven iz algi. Kao primjere u tablici. 6.2 prikazuje sastave najčešćih kulturnih medija.
Okolina Murashigea i Skooga najsvestranija je. Pogodan je za stvaranje kalusa, održavanje neorganiziranog rasta kalusa i induciranje morfogeneze u većini dvodomnih biljaka. Dakle, promjena omjera auksina i kinetina dovodi do stvaranja bilo kojeg korijena (prevladavanje auksina), ili; matične kulture (prevladavanje kinetina).
Medij Gamborg i Eveleg dobro je pogodan za uzgoj stanica i tkiva mahunarki i žitarica, Whiteov medij omogućuje * ukorjenjivanje izdanaka i normalan rast stabljike nakon regeneracije, a medij Nitsch i Nitsch pogodan je za indukciju androa-ipostanak u kulturi antera.
Fizički čimbenici. Za rast i razvoj biljnih tkiva; in vitro fizički čimbenici - svjetlost, imaju veliki utjecaj; temperatura, prozračivanje, vlaga. |
Svjetlo. Većina tkiva kalusa može rasti u uvjetima slabog osvjetljenja ili mraka, jer nisu sposobna za fotografiranje *; sintetizirati.Istodobno, svjetlo može djelovati kao faktor koji po drugi put osigurava morfogenezu i aktivira procese.
|
!Sastav hranjivih medija koji se koriste u uzgoju stanica i tkiva (prema R. G. Butenku, 1999.) |
Koncentracija hranjivih podloga, mg / l |
|||
|
Medijska komponenta |
Murashige i |
Gamborg i |
Bijela, |
Nič i Nič, |
|
Skoog, 1962 |
Evelega, 1968 |
1939 |
1974-1975 |
|
|
KN03 |
1900 |
3000 |
81 |
950 |
|
NH4NO3 |
1650 |
— |
— |
720 |
|
Ca (N03)2 |
— |
— |
142 |
— |
|
Ca (N03)2-4H20 |
— |
— |
— |
— |
|
(NH4)2S04 |
— |
134 |
— |
— |
|
MgS04-7H20 |
370 |
500 |
74 |
185 |
|
CaCl2H20 |
— |
— |
166 |
|
|
CaClr2H20 |
440 |
150 |
— |
— |
|
KC1 |
— |
65 |
— |
|
|
KH2P04 |
170 |
— |
12 |
68 |
|
NaH2P04H20 |
— |
150 |
— |
— |
|
MnS04H20 |
— |
10 |
— |
— |
|
MnS0 „-4H20 |
22,3 |
— |
— |
25 |
|
ZnS04-4H20 |
8,6 |
— |
— |
— |
|
ZnS04-7H20 |
— |
2 |
— |
10 |
|
H3B04 |
6,2 |
3 |
— |
10 |
|
CuS04-5H20 |
0,025 |
0,075 |
— |
0,025 |
|
Na2Mo04-2H20 |
0,25 |
0,25 |
— |
0,25 |
|
CoCl2-6H20 |
0,025 |
— |
— |
— |
|
FeS04-7H20 |
27,8 |
— |
— |
27,8 |
|
Na EDTA-2H20 |
37,3 |
— |
— |
37,3 |
|
Sequestrene 330-Fe |
28 |
— |
— |
|
|
Mezoinozitis |
100 |
— |
— |
200 |
|
Vitamin C |
— |
— |
— |
3 |
|
Tiamin-HCl |
0,5 |
— |
— |
3 |
|
Piridoksin-HCl |
0,5 |
— |
— |
1 |
|
Nikotinska kiselina |
0,5 |
— |
— |
— |
|
Saharoza |
30 000 |
20000 |
2000 |
60 000 |
|
Agar "Difco", gel |
— |
— |
— |
7000 |
|
rith, agaroza |
||||
sinteza. Kao izvor svjetlosti koriste se fluorescentne svjetiljke. Za većinu zeljastih biljaka optimalno osvjetljenje je oko 1000 luksa. Prenisko (300 lux) ili visoko (3000-10.000 lux) osvjetljenje inhibira rast. Osvjetljenje može utjecati na metabolizam stanica kalusa. Tako se u kulturama biljaka čaja biosinteza polifenola povećala pod utjecajem svjetlosti. Naprotiv, u staničnoj kulturi Scopolia parvi- flora svjetlo je potisnulo stvaranje alkaloida. Osim intenziteta osvjetljenja, kvaliteta svjetlosti utječe na kulturu tkiva i njegove fiziološke karakteristike. Tako se u staničnim kulturama peršina nakon osvjetljavanja kontinuiranim luminiscentnim svjetlom "hladno bijelo" stvara više od 20 flavona i flavonol glikozida. Istodobno se sinteza flavonskih glikozida aktivira uzastopnim zračenjem ultraljubičastom svjetlošću, a zatim svjetlo koje leži u području "crveno-dugovalno crveno"
Temperatura. Za većinu kultura kalusa optimalna temperatura je 26 ° C. Istodobno, kalusi i stanične kulture Dioscorea deltoida dobro rastu čak i pri temperaturi od 32 ° C. V. Za razliku od rasta stanica i tkiva, indukcija njihove morfogeneze zahtijeva niže temperature (18 - 20 ° C). Učinak temperature na stanični metabolizam in vitro slabo proučeno. Postoje dokazi da je u kulturama kalusa maksimalno stvaranje alkaloida uočeno pri temperaturi od 25 ° C, a s porastom temperature naglo se smanjilo. U suspenzijskim staničnim kulturama Ipomoea sadržaj masnih kiselina značajno se povećao ako su uzgojene na suboptimalnim temperaturama rasta (15 ° C) Stoga se pri uzgoju kulture in vitro potrebno je pažljivo proučiti utjecaj svih abiotičkih čimbenika, uključujući temperaturu, na rast i metabolizam stanica.
Prozračivanje. Za uzgoj suspendiranih usjeva prozračivanje je od velike važnosti. Posebno je važno opskrbiti uzgojene stanice zrakom u velikim količinama fermentora.
Uspoređujući različite vrste fermentatora, pokazalo se da je sinteza sekundarnih metabolita u suspenzijskoj kulturi najveća kada se zrak dovodi odozdo. Kod uzgoja stanica u malim količinama (u tikvicama) postiže se normalno prozračivanje uz stalno miješanje suspenzije.
Vlažnost. Optimalna vlažnost u prostoriji u kojoj uzgajam! Usjevi bi trebali biti 60 - 70%.
Dakle, uzgoj stanica i tkiva ovisi o mnogim čimbenicima vanjskog okruženja, a njihovo djelovanje nije uvijek dobro? stno. Stoga je pri uvođenju nove biljne vrste u kulturu potrebnoT Prije svega, potrebno je pažljivo proučiti utjecaj fizičkih čimbenika na rast i fiziološke karakteristike ove kulture.
Uzgoj izoliranih stanica i tkiva na umjetnim hranjivim podlogama u sterilnim uvjetima (in vitro) naziva se metoda uzgoja izoliranih tkiva.
Zbog činjenice da su sjemenske biljke od najveće važnosti u životu čovjeka, metode i uvjeti za njihov uzgoj bolje su razvijeni nego za golosjemenjače ili alge, čiji uzgoj u sterilnim uvjetima izaziva određene poteškoće. No, bez obzira na pripadnost biljaka određenoj taksonomskoj skupini, postoje opći zahtjevi za uzgoj objekata u kulturi in vitro.
Asepsa. Prije svega, uzgoj fragmenata tkiva ili biljnih organa - eksplantati, a još više za pojedinačne stanice, zahtijeva potpunu asepsu.Mikroorganizmi koji mogu ući u hranjivi medij oslobađaju toksine koji inhibiraju rast stanica i dovode kulturu do smrti, stoga se tijekom svih manipulacija sa stanicama i tkivima tijekom in vitro uzgoja poštuju određena aseptična pravila.
Mediji za kulturu. Izolirane stanice i tkiva uzgajaju se na višekomponentnim hranjivim podlogama. Po svom sastavu mogu se značajno razlikovati, međutim, sastav svih medija nužno uključuje makro- i mikroelemente potrebne biljkama, ugljikohidrate, vitamine, fitohormone i njihove sintetičke analoge. Ugljikohidrati (obično saharoza ili glukoza) uključeni su u bilo koju hranjivu smjesu u koncentraciji od 2-3%. Oni su neophodni kao nutritivna komponenta, budući da većini tkiva kalusa nedostaje klorofil i nisu sposobni za autotrofnu prehranu. Stoga se uzgajaju u uvjetima difuznog osvjetljenja ili u mraku. Obvezne komponente kulturnih medija trebaju biti auksini koji uzrokuju dediferencijacija eksplantne stanice i citokinini koji induciraju diobu stanica. Kada se omjer između ovih fitohormona promijeni ili kada se dodaju drugi fitohormoni, pojavljuju se različite vrste morfogeneza.
Fizički čimbenici. Na rast i razvoj biljnih tkiva in vitro uvelike utječu fizički čimbenici - svjetlost, temperatura, prozračivanje, vlaga. Većina tkiva kalusa može rasti u uvjetima slabog osvjetljenja ili mraka jer nisu u stanju fotosintezirati. Istodobno, svjetlo može djelovati kao faktor koji osigurava morfogenezu i aktivira procese sekundarne sinteze. Za većinu kultura kalusa optimalna temperatura je 26 ° C. Za uzgoj suspendiranih usjeva prozračivanje je od velike važnosti. Posebno je važno opskrbiti uzgojene stanice zrakom u velikim količinama fermentora. Optimalna vlažnost u prostoriji u kojoj rastu usjevi trebala bi biti 60-70%. Dakle, uzgoj stanica i tkiva ovisi o mnogim čimbenicima okoliša, a njihov učinak nije uvijek dobro poznat. Stoga je pri uvođenju nove biljne vrste u kulturu potrebno, prije svega, pažljivo proučiti utjecaj fizikalnih čimbenika na rast i fiziološke karakteristike ove kulture.
Datum dodavanja: 2016-06-02; pregledi: 493;
VIDI VIŠE:
Proces uzgoja Stanice i tkanine na umjetnim hranjivim medijima u sterilnim uvjetima (in vitro) naziva se metoda dobivanja kulture izoliranog tkiva. Obično je kultura izoliranog tkiva žulj a mnogo rjeđe tumorskih tkiva (slike 3.1. i 3.2).
Kulture izoliranih stanica i tkiva.
Korištenje kulture izoliranih stanica i tkiva.
Izolirane kulture tkiva široko se koriste u poljoprivredi i industrijskoj proizvodnji. Posjeduju prednosti u usporedbi s tradicionalnim biljnim materijalima (samoniklo i plantažno uzgojeno bilje), i to:
1. Neovisnost o vanjskim uvjetima.
2. Optimiziranje uvjeta uzgoja.
3. Automatizacija i informatizacija procesa.
4. Sposobnost uzgoja ugroženih biljnih vrsta.
5. Mogućnost masovnog klonskog mikropropagiranja voća i povrća i ukrasnog bilja.
6. Oporavak od virusnih i drugih infekcija.
7. Prilika kroz kulturu in vitro, proširenje područja uzgojnog rada, odnosno dobiti klonovi stanice, zatim biljke s programiranim svojstvima.
Zbog sposobnosti stanica da se sintetiziraju u kulturi sekundarni metaboliti, nastala je nova grana industrije koja provodi biološku sintezu tvari neophodnih čovjeku.
Uvjeti za uzgoj tkiva i stanica.
Uzgoj fragmenata tkiva ili jedne biljke - eksplantati, a još više za pojedinačne stanice, zahtijeva potpunu asepsu.
Izlučuju mikroorganizmi koji mogu ući u medij za uzgoj toksinainhibira rast stanica i dovodi kulturu do smrti. Stoga, sve manipulacije sa stanicama i tkivima tijekom uzgoja in vitro provedeno u skladu s određenim pravilima asepse u laminarna kutija ili u aseptičnim prostorijama. Asepsa se postiže opskrbom sterilnim zrakom koji prolazi kroz filtre, usmjeren iz laminarne kutije prema van. Na površini biljnih tkiva uvijek postoji epifitska mikroflora. Stoga je nužna površinska sterilizacija, koja se postiže tretiranjem područja biljaka od kojih će se izolirati eksplantati, dezinficijensi (vodikov peroksid, živin klorid).
Za rad s biološkim materijalom potrebne su sljedeće komponente:
- čisto posuđe i bioreaktor (fermentor);
- sterilni hranjivi medij;
- optimalno osvjetljenje;
- optimalna temperatura;
- optimalna vlaga;
- prozračivanje.
Očistite posuđe i fermentor. Instrumenti i vata prethodno umotani u papir ili foliju steriliziraju se suhom toplinom ormar za sušenje na temperaturi od 160 ° C 1,5-2 sata.
Pri korištenju različitih vrsta fermentatora utvrđeno je da se fiziološka svojstva kultura mogu promijeniti pa bi sintezu sekundarnih metabolita u suspenzijskoj kulturi trebalo provesti uz dovod zraka odozdo. U tim uvjetima sinteza se odvija mnogo aktivnije (slika 3.3).
Kod uzgoja stanica u malim količinama, na primjer, u bocama, postiže se normalna aeracija uz stalno miješanje suspenzije.
Mediji za kulturu... Uzgoj izoliranih stanica i tkiva odvija se u više komponenti hranjivi mediji... Po svom sastavu mogu se značajno razlikovati, međutim, sastav svih medija nužno uključuje i komponentu temelj, kojima se dodaju skupine tvari potrebnih biljkama: makro- i mikroelementi, ugljikohidrati, vitamini i fitohormoni. Takva komponentna baza je agar -agar - polisaharid algi, sposoban stvarati gelove u vodi koji se učvršćuju na 45 ° C. Može se dodati u medij za uzgoj endosperma nezreli embriji (kokos, konjski kesten), sirup neka stabla, različita ekstrakti (slad, kvasac), sok od rajčice. Njihovo uvođenje u okoliš daje pozitivan rezultat. Međutim, svaka aktivna komponenta ima samo njoj svojstvene tehnološke karakteristike.
Riža. 3.3. Bioreaktor (fermentor) za uzgoj mikroorganizama, stanica ili tkiva
Dediferencijacija je osnova procesa stvaranja žuljeva.
Dediferencijacija je povratak specijaliziranih stanica u meristematsko stanje kada dobiju sposobnost diobe.
Organi i tkiva biljaka služe kao polazni materijal za dobivanje kultura stanica i tkiva, no za to se češće koriste listovi biljaka.
Prethodno obrađen sterilni ulomak lista stavlja se na čvrsti hranjivi medij. Listovi se sastoje od različitih tkiva čije se stanice diferenciraju i sintetiziraju različite molekule proteina, ugljikohidrata, lipida i drugih tvari karakterističnih za te stanice. Ove diferencirane stanice nemaju sposobnost dijeljenja.
U procesu mehaničkih oštećenja lima oslobađa se eksplant, a pod utjecajem biljnih hormona dodanih u okoliš, auksini i citokinini stanica je dediferencirana. Gubi skladišne tvari - škrob, proteine, lipide, specijalizirane organele, kloroplaste itd. Kao rezultat toga sve stanice stječu nova bliska morfološka i fiziološka svojstva, t.j. postaju kalusne (diobene) stanice. Na eksplantatu lista nastaje žuljevito tkivo.
Vrste staničnih kultura. Ovisno o načinu i uvjetima uzgoja, postoji nekoliko vrsta kultura stanica i tkiva:
- kultura kalusa;
- kultura suspenzije;
- kultura jedne stanice.
Ako uzgoj događa se površno na hranjivi medij agar, tada nastaje žuljevito tkivo. Nema jasnu strukturu, ali može varirati u gustoći. Podrijetlo i uvjeti uzgoja određuju je li tkivo kalusa labavo, srednje gustoće ili gusto.
Opće karakteristike stanica kalusa. Stanica kalusa ima niz zajedničkih svojstava sa svima biljne stanice... To je ontogeneza stanica, otpornost na određene nepovoljne čimbenike okoliša i druga svojstva. Istodobno, tijekom uzgoja, stanice kalusa stječu svoje individualne karakteristike, poput fiziološke asinhronije, genetske heterogenosti i nekih drugih.
Fiziološka asinkronija leži u činjenici da se stanice u svakom trenutku nalaze u različitim fazama rasta: neke se dijele, druge rastu, a neke već stare. Stoga se opće fiziološko starenje cijele populacije stanica kalusa obično procjenjuje prema stanju većine stanica (slika 3.4).
Riža. 3.4. Stanice kalusa uRiža. 3.5. Protoplast izlazi kroz
Datum dodavanja: 2016-05-28; pregledi: 1915;
Slični članci:
